Poliklonska antitijela

Poliklonska antitijela (pAbs) (pAbs) su antitijela koja se izlučuju iz različitih linija B-ćelija unutar tijela, dok monoklonska antitijela potiču iz jedne jedine ćelijske loze. Oni su skup imunoglobulinskih molekula koje reagiraju protiv određenog antigena, pri čemu svaki identificira različit epitop.

Proizvodnja

Općii postupak za proizvodnju poliklonskih antitijela je slijedeći:

1. Priprema antigena;
2. Selekcija i priprema adjuvanata;
3. Izbor životinja;
4. Proces ubrizgavanja;
5. Ekstrakcija krvnog seruma.

Konjugat antigen/adjuvans ubrizgava se životinji po izboru kako bi se pokrenuo pojačani imunski odgovor. Nakon niza injekcija tokom određenog vremenskog perioda, očekuje se da će životinja stvoriti antitela protiv konjugata. Zatim se iz životinjama ekstrahira krv, a zatim se pročisti kako bi se dobilo antitijelo od interesa. Inokulacija se izvodi na prikladnom sisaru, kao što su miš, zec ili kozaj. Često su poželjni veći sisari jer je količina seruma koja se može prikupiti veća. U sisare se ubrizgava antigen. To inducira B-limfocite da proizvode IgG imunoglobulin specifičan za antigen. Ovaj poliklonski IgG pročišćen je iz seruma sisara.

Suprotno tome, monoklonska antitijela su izvedena iz jedne jedine ćelijske linije. Postoje mnoge metodologije za proizvodnju poliklonskih antitijela kod laboratorijskih životinja. Institucijske smjernice koje reguliraju upotrebu životinja i postupke koji se odnose na te metodologije općenito su orijentirane na humana razmatranja i primjereno ponašanje za upotrebu adjuvans (sredstva koja mijenjaju učinak drugih uzročnika, dok imaju malobrojne, ako bilo kakve izravne učinke, ako ih daju sami) . To uključuje izbor adjuvansa, rute i mjesta primjene, količinu ubrizgavanja po mjestu i broj mjesta na životinji. Institucijske politike obično uključuju dozvoljene količine krvi po uzimanju i mjere opreza, uključujući odgovarajuće zadržavanje i sedaciju ili anesteziju životinja radi sprečavanja ozljeda životinja ili osoblja.

Primarni cilj proizvodnje antitijela kod laboratorijskih životinja je postizanje visokog titra, visokog afiniteta antiseruma za upotrebu u eksperimentima ili dijagnostičkim testovima. Adjuvansi koriste se za popravak ili poboljšanje imunskog odgovora na antigene. Većina adjuvanasa predviđa mjesto ubrizgavanja, depo antigena koji omogućava sporo oslobađanje antigena u drenažne limfne čvorove.

Mnogi adjuvansi također sadrže ili djeluju direktno kao:

1. površinski aktivnia tvari koje promoviraju koncentraciju proteinskih molekula na velikoj površini i
2. imunostimulirajuće molekule ili svojstva. Adjuvansi se obično koriste sa topivim proteinskim antigenima za povećanje titra antitijela i induciranje produženog odgovora sa pratećom memorijom.

Takvi antigeni sami po sebi su uglavnom loši imunogeni. Većina složenih proteinskih antigena inducira više B-ćelijskih klonova za vrijeme imunološkog odgovora, pa stoga je reakcija poliklonska. Imunski odgovori na neproteinske antigene uglavnom su slabi ili pojačani pomoću adjuvansa i nemaju sistemske memorije.

Antitijela se također proizvode od izolata humanih B-limfocita za proizvodnju specifičnih rekombinantnih smješa monoklonskih antitela. Biotehnološka kompanija, Symphogen, razvija ovaj tip antitijela za terapijsku upotrebu. Oni su prva istraživačka kompanija koja je dostigla dvije faze ispitivanja sa monoklonskim mješavinama antitela koja oponašaju raznolikost antitela, kao poliklonskih lijekova. Ova proizvodnja sprječava prijenos virusa i priona i to je jednostavan postupak.

Izbor životinja

Životinje koje se često koriste za proizvodnju poliklonskih antitijela uključuju piliće, koze, zamorce, hrčke, konje, miševe, pacove i ovce. Međutim, kunić je u te svrhe najčešće korištena laboratorijska životinja. Izbor životinja treba temeljiti na:

1. potrebnoj količini antitiiela,
2. odnosu između davatelja antigena i primatelja proizvedenih antitijela (općenito, što su filogenetski udaljeniji, veći je potencijal za odgovor na antitijelo visokog titra) i
3. potrebnim svojstvima (npr. klasa, podrazred (izotip), komplement koji fiksira prirodu antitijela koja treba napraviti. Imunizacija i flebotomija povezani su sa stresom i, barem kada se koriste zečevi i glodari, preferiraju se životinje bez specifičnih patogena (SPF). Upotreba takvih životinja može dramatično smanjiti morbiditet i smrtnost zbog patogenih organizama, posebno ‘’Pasteurella multocida“ kod kunića.

Koze ili konji se obično koriste kada su potrebne velike količine antiseruma. Mnogi istraživači favoriziraju piliće, zbog filogenetske udaljenosti od sisara. Pilići donose velike količine IgY (IgG) u žumancetu, a skupljanje antitijela iz jaja eliminira potrebu za invazivnim postupkom krvarenja. Jaja u jednoj sedmici mogu sadržavati 10 puta više antitijela od volumena krvi kunića dobijenog jednosedmičnim krvarenjem. Međutim, postoje i neki nedostaci kada se primjenjuju određena antitijela koja se dobijaju od pilića u imunološkim testovima. Pileći IgY ne fiksira komponentu komplementa sisara i ne djeluje kao taložno antitijelo koristeći standardne otopine. Iako se miševi najčešće koriste za proizvodnju monoklonskih antitijela, njihova mala veličina obično sprečava njihovu upotrebu za dovoljne količine poliklonalnih antitijela u serumu. Međutim, poliklonska antitijela kod miševa mogu se prikupiti iz peritoneumske tekućine koristeći bilo koji od niza metodologija za njenu proizvodnju.

Kada koristite zečeve, mlade odrasle životinje (od 2,5-3,0 kg) treba koristiti za primarnu imunizaciju zbog snažnog odgovora antitela. Vrhovi imunske funkcije u pubertetu i primarni odgovori na nove antigene opadaju s godinama. Ženke zečeva općenito preferiraju jer su poslušnije i smatra se da posjeduju snažniji imunski odgovor od mužjaka. Najmanje dvije životinje po antigenu trebaju se upotrijebiti kada se koriste uginule životinje. Ovaj princip smanjuje potencijalni potpuni neuspjeh koji je posljedica neodgovaranja na antigene pojedinih životinja.

Priprema antigena

Veličina, opseg agregacije i relativna aktivnost proteinskih antigena mogu dramatično uticati na kvalitet i količinu proizvedenih antitela. Mali polipeptidi (<10 ku) i neproteinski antigeni općenito trebaju biti konjugirani ili umreženi u veće, imunogene, proteinske nosače da bi povećali imunogenost i osigurali ćelijski epitop. Općenito, što je veći imunogeni protein to je bolje. Veći proteini, čak i u manjim količinama, obično rezultiraju boljim angažmanom antigena koje predstavljaju ćelije za obradu antigena za zadovoljavajući imunski odgovor. Injekcija rastvorljivih, neagregiranih proteina ima veću vjerovatnost za indukciju tolerancije nego zadovoljavajući odgovor antitijela.

Hemocijaninske ključanice (KLH) i albumin iz goveđeg seruma dva su široko korištena proteinska nosača. Poli-L-lizin se takođe uspešno koristi kao okosnica za peptide. Iako upotreba poli-L-lizina smanjuje ili eliminira proizvodnju antitijela na strane proteine, to može rezultirati neuspjehom proizvodnje antitijela izazvanih peptidom. U posljednje vrijeme liposomi se također uspješno koriste za isporuku malih peptida i ova je tehnika alternativa isporuci uljnim adjuvansima emulzije.

Ključni prsten hemocijanina (KLH) albumina iz goveđeg seruma dva su široko korištena proteinska nosača. Poli-L-lizin se također uspješno koristi kao okosnica za peptide. Iako upotreba poli-L-lizina smanjuje ili eliminira proizvodnju antitijela na strane proteine, to može rezultirati neuspjehom proizvodnje antitijela izazvanih peptidom. U posljednje vrijeme liposomi se također uspješno koriste za isporuku malih peptida i ova je tehnika alternativa isporuci uljnim dodacima emulzije.

Količina antigena

Izbor količine antigena za imunizaciju varira ovisno o svojstvima antigena i odabranom adjuvansu. Općenito, količine mikrograma do miligrama proteina u adjuvansu su potrebne da bi se dobilo antitijelo visokog titra. Doziranje antigena uglavnom je povezano s vrstama, a ne tjelesnom težinom. Takozvani "prozor" imunogenosti kod svake vrste je širok, ali previše ili premalo antigena može izazvati toleranciju, supresiju ili imunsku devijaciju prema ćelijskoj imunosti, a ne zadovoljavajući humoralni odgovor. Optimalne i uobičajene razine antigena proteina za imuniziranje specifičnih vrsta zabilježene su u sljedećim rasponima:

1. zec, 50-1000  µg;
2. miš, 10–50  µg;
3. zamorac, 50–500 µg; i
4. koza, 250–5000  µg.

Izvještava se da su optimalne „početne“ doze na kraju svakog raspona. Afinitet serumskih antitijela povećava se s vremenom (mjesecima) nakon ubrizgavanja mješavine antigenskih adjuvansa i kako se antigen u sistemu smanjuje. Široko korištene doze antigena za "pojačivače" ili sekundarne imunizacije obično su jedna polovina jednaka početnim dozama. Antigeni ne bi trebali sadržavati preparativne nusprodukte i kemikalije poput poliakrilamidnog gela, SDS-a, ureje, endotoksina, čestica i ekstremnih vrijednosti pH.

Peptidna antitijela

Kada se peptid koristi za stvaranje antitijela, vrlo je važno pravilno dizajnirati antigene. Postoji nekoliko resursa koji mogu pomoći u dizajnu, kao i tvrtke koje nude ovu uslugu. Expasy je skupio skup javnih alata na sajtu ProtScale stranici za navigaciju za koju je potreban određeni stupanj korisničkog znanja. Za jednostavniji alat za ocjenjivanje peptida dostupan je alat Antigen Profiler Arhivirano 30. 7. 2012. na Wayback Machine koji će vam omogućiti ocjenu pojedinačnih sekvenci peptida na temelju relativne baze podataka mapiranja epitopa iz prethodnih imunogena koji se koriste za stvaranje antitijela. Konačno, u pravilu peptidi trebaju slijediti neke osnovne kriterije. Prilikom ispitivanja peptida na sintezu i imunizaciju, preporučuje se izbjegavanje određenih ostataka i sekvenci zbog potencijalnih problema sinteze. To uključuje neke od češćih karakteristika:

• Ekstremno duga ponavljanja iste aminokiseline (npr. RRRR)
• Dupliđe serije serina (S), treonina (T), alanina (A) i valina (V)
• Završavanje ili započinjanje niza s prolinom (P)
• Glutamin (Q) ili asparagin (N) na n-kraju
• Peptidi prekomjerni s hidrofobnim ostacima (npr. V, A, L, I, itd.)

Reaktivnost

Istražitelji bi tako trebali razmotriti status nativnosti proteinskih antigena kada se koriste kao imunogeni i reagiraju s proizvedenim antitijelima. Antitijela na nativne proteine najbolje reagiraju s nativnim proteinima, a antitijela na denaturirane proteine najbolje reagiraju s denaturiranim proteinima. Ako će izazvana antitijela biti korištena na membranskim bojama (proteini podvrgnuti denaturirajućim uvjetima), tada bi se antitijela trebala napraviti protiv denaturiranih proteina. S druge strane, ako će se antitijela upotrebiti za reakciju s nativnim proteinima ili blokirati aktivno mjesto proteina, tada bi antitijela trebalo da se stvaraju protiv nativnog proteina. Adjuvansi često mogu mijenjati nativnost proteina. Općenito, apsorbirani proteinski antigeni u prethodno formiranom adjuvansu emulzije ulje u vodi zadržavaju veću prirodnu strukturu proteina od one u emulzijama voda u ulju.

Aseptičnost

Antigene uvijek treba pripremati primjenom tehnika kojima se osigurava da nisu kontaminirani mikrobima. Većina proteinskih preparata može se sterilizirati prolaskom kroz 0,22 μm filter. Septički apscesi često se javljaju na mjestima inokulacije životinja kada se koriste kontaminirani pripravci. Ovo može rezultirati neuspjehom imunizacije protiv ciljanog antigena.

Adjuvansi

Postoje mnogi komercijalno dostupni imunski adjuvansi. Izbor specifičnih adjuvansa ili tipova varira ovisno o tome hoće li se koristiti za istraživanje i proizvodnju antitijela ili za razvoj vakcina. Adjuvansi za upotrebu vakcija trebaju samo da proizvode zaštitna antitijela i dobru sistemsku memoriju, dok oni za proizvodnju antiseruma moraju brzo inducirati antitijela visokog titra i visokog aviditeta. Nijedan pojedinačni adjuvans nije idealan za sve svrhe i svi imaju prednosti i nedostatke. Upotreba adjuvanasa općenito je praćena neželjenim nuspojavama različite težine i trajanja. Istraživanje novih adjuvanasa fokusira se na supstance koje imaju minimalnu toksičnost, uz zadržavanje maksimalne imunostimulacije. Istražitelji bi uvijek trebali biti svjesni potencijalne boli i nevolja, koje su povezane s primjenom adjuvansa na laboratorijskim životinjama. Najčešće korišteni adjuvansi za proizvodnju antitijela su Freundov, Alum, Ribi Adjuvant System i Titermax.

Freundovi adjuvansi

Postoje dvije osnovne vrste Freundovog adjuvansa: potpuni (FCA) i nepotpuni (FIA). FCA je emulzija tipa voda u ulju koja lokalizira antigen za razdoblja otpuštanja do 6 mjeseci. Formuliran je s mineralnim uljem, monolatom površinski aktivnog manitata i toplinom usmrćenim Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium butyricum ili njihovim ekstraktima (za nakupljanje makrofaga na mjestu inokulacije). Ovaj moćni adjuvans stimulira i ćelijski posredovanu i humoralnu imunost preferencijalnom indukcijom antitijela protiv epitopa denaturiranih proteina. Iako je FCA u prošlosti najčešće korišteni adjuvans, jedna je od toksičnijih tvari zbog nemetabolizirajućeg mineralnog ulja i izaziva granulomatozne reakcije. Njegova je upotreba ograničena na laboratorijske životinje i treba ga koristiti samo sa slabim antigenima. Ne smije se koristiti više od jednom kod jedne životinje jer višestruke FCA inokulacije mogu prouzrokovati ozbiljne sistemske reakcije i smanjene imunološke reakcije. Freundov nepotpuni adjuvans ima istu formulaciju kao FCA, ali ne sadrži mikobakterije ili njegove komponente. FIA je obično ograničen na povećavajuće doze antigena, jer je obično mnogo manje efikasan od FCA za primarnu indukciju antitijela. Freundovi adjuvansi se normalno miješaju s jednakim dijelovima antigenskih pripravaka da nastanu stabilne emulzije.

Ribi adjuvantni sistem

Ribi adjuvansi su emulzije ulja u void, u kojima se antigeni miješaju sa malim količinama metabolizabilnog ulja (skvalena) koji se zatim emulgiraju s fiziološkom otopinom koja sadrži surfaktan polisorbat 80. Ovaj sistem sadrži i rafinirane mikobakterijske proizvode (faktor kablovske ploče, skelet ćelijskog zida) kao I imunostimulansi i bakterijski monofosforil lipid A. Dostupne su tri različite vrste orijentirane formulacije adjuvantnog sistema. Ti adjuvansi stupaju u interakciju s membranama imunskih ćelija što rezultira indukcijom citokina, pospješujući unošenje, obradu i prezentaciju antigena. Ovaj adjuvantni sistem je mnogo manje toksičan i manje jak od FCA, ali generalno inducira zadovoljavajuće količine antitijela velike avidnosti protiv proteinskih antigena.

Titermax

Titermax predstavlja noviju generaciju adjuvansa koji su manje toksični i ne sadrže biološki izvedene materijale. Zasniva se na mješavinama površinski aktivnih tvari, linearnih, blokova ili lanaca neionskih kopolimera polioksipropilena (POP) i polioksietilena (POE). Ovi kopolimeri su manje toksični od mnogih drugih površinski aktivnih materija i imaju snažna adjuvantna svojstva koja favoriziraju hemotaksiju, aktivaciju komplementa i proizvodnju antitijela. Titermaxni adjuvans formira mikročestica+e emulzije voda u ulju s kopolimerom i metabolizirajućim skvalenskim uljem. Kopolimer je obložen česticama silikagela koje stabilizirauju emulziju, što omogućava ugradnju velike količine antigenskih materijala. Pomoćni aktivni kopolimer formira hidrofilne površine, koje aktiviraju komplement, imunske ćelije i pojačanu ekspresiju glavnih molekula histokompatibilnosti klase II na makrofagovima. Titermax predstavlja antigen u visoko koncentriranom obliku imunskom sistemu, što često rezultira titrom antitijela uporedivim ili višim od FCA.

Specol je adjuvans tipa voda u ulju, načinjen od pročišćenog mineralnog ulja. Zabilježeno je da kod kunića i drugih laboratorijskih životinja podstiče imunski odgovor uporediv sa Freundovim adjuvansom, stvarajući manje histoloških lezija.

Farmaceutska upotreba

Digoksinski imunski Fab je antigen vezujući fragment poliklonalnih antitijela uzgojen na derivativu Digitalisa, kao hapten vezan na protein i koristi se za preokret po život opasnog digoksina ili digitoksinske toksičnosti. Rho(D) imunski globulin napravljen je iz skupljene ljudske plazme koju osiguravaju Rh-negativni donori sa antitijelima na D-antigen. Koristi se za osiguravanje pasivnog imunskog vezanja antigena, sprečavajući majčinski aktivni imunski odgovor koji bi mogao potencijalno rezultirati hemolitskom bolešću novorođenčeta. Rozrolimupab je anti-RhD rekombinantno ljudsko poliklonsko antitijelo koje se sastoji od 25 jedinstvenih IgG1 antitijela i koristi se za liječenje imunske purpurne trombocitopenije i prevenciju izoimunizacije kod Rh-negativnih trudnica.

Prednosti

Upotreba poliklonskih antitijela (PAb-ova) nad monoklonskim antitijelima ima svoje prednosti. Tehničke vještine potrebne za proizvodnju poliklonskih antitijela nisu tako zahtjevne. Izrada ih je jeftina i mogu se proizvesti prilično brzo, a za proizvodnju potrebno je tek nekoliko mjeseci. PAb su heterogeni, što im omogućava da se vežu za širok spektar antigenskih epitopa. Budući da se PAb proizvode iz velikog broja B-ćelijskih klonova, vjerojatnije je da se uspješno vežu za određeni antigen. PAb ostaju stabilni u različitim okruženjima, poput promjene pH vrijednosti ili koncentracije soli, što im omogućava da budu primjenjiviji u određenim postupcima. Uz to, ovisno o potrebnoj količini, PAb se mogu proizvesti u velikim količinama u odnosu na veličinu životinje koja se koristi.

Također pogledajte

• B-ćelija
• Monoklonska antitijela
• Poliklonski odgovor

Vanjski linkovi

• Nature News piece on polyclonal antibody therapy
• Immunological Measures of Antigenicity (online textbook, see section 11.1.)
• Polyclonal antibody in Dictionary of Cell and Molecular Biology
• Generating antibodies at openwetware (technical description for researchers)
• Polyclonal vs Monoclonal Antibodies